LRRC15+ 筋線維芽細胞は腫瘍免疫を抑制する間質の設定値を決定する

Jun 24, 2023

Nature volume 611、pages 148–154 (2022)この記事を引用

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メトリクスの詳細

マウスとヒトの両方における癌の最近の単細胞研究では、高度に制限されたロイシンリッチリピート含有タンパク質 15 (LRRC15) によって特異的に特徴づけられる筋線維芽細胞集団の出現が確認されました 1,2,3。しかし、LRRC15+ 癌関連線維芽細胞 (CAF) の発生の基礎となる分子シグナルと、それらが抗腫瘍免疫に与える直接的な影響は、特徴付けられていません。今回、膵臓がんのマウスモデルにおいて、我々は、健康なデルマトポンチン＋普遍的線維芽細胞におけるTGFβ受容体2型シグナル伝達が、がん関連LRRC15＋筋線維芽細胞の発生に必須であるという生体内遺伝的証拠を提供する。この軸はまた、ヒトの癌における線維芽細胞系統の多様性を主に推進します。新しく開発されたLrrc15-ジフテリア毒素受容体ノックインマウスを使用して、LRRC15+ CAFを選択的に枯渇させ、この集団の枯渇により腫瘍の総線維芽細胞含有量が著しく減少することを示した。さらに、CAF 組成は普遍的な線維芽細胞に向けて再調整されます。これにより、腫瘍浸潤 CD8+ T 細胞の直接抑制が緩和され、そのエフェクター機能が強化され、抗 PDL1 免疫チェックポイント遮断に応答して腫瘍退縮が増強されます。まとめると、これらの発見は、TGFβ依存性LRRC15+ CAFが腫瘍増殖を促進する腫瘍線維芽細胞の設定値を決定することを実証している。これらの細胞はまた、CD8+ T 細胞機能を直接抑制し、チェックポイント遮断に対する応答性を制限します。疾患誘発性の LRRC15+ 筋線維芽細胞の数を減らすことによって恒常性線維芽細胞の設定値を回復する治療法の開発により、患者の生存率と免疫療法に対する反応が改善される可能性があります。

CAF は、腫瘍微小環境 (TME) の形成とがん免疫療法への反応において重要な役割を果たしています 4、5、6。免疫チェックポイント阻害（ICB）療法を受けた患者の腫瘍からの遺伝子発現データに関するこれまでの研究では、CAFの存在量と免疫療法に対する反応の欠如との関連性が推測されている7、8。 CAFを適切に標的とする治療薬はこの耐性を軽減する可能性があるが、CAFの不均一性の理解と臨床的に関連するサブセットの同定が不完全であるため、依然として限界がある。単一細胞 RNA シーケンス (scRNA-seq) の使用により、健康な組織と病気の組織における間質細胞の状況の解像度が向上しました。膵管腺癌（PDAC）および乳癌におけるCAF進化のscRNA-seq解析により、LRRC15によってマークされる活性化筋線維芽細胞（マウスとヒトの両方）が優勢であることが特定された（参考文献1、2、3）。この CAF 集団は、細胞外マトリックスと免疫抑制に関連する多数の遺伝子を発現します 1、9、10。臨床的には、がん患者のバルク RNA-seq データにおける LRRC15+ CAF 遺伝子シグネチャーの高発現は、抗プログラムデスリガンド 1 (PDL1) ICB1 に対する応答の欠如と関連していました。 LRRC15+ CAF がこの反応の欠如の根底にあるのか、それとも関連性を促進する腫瘍固有の特徴の読み取りを表すのかは依然として不明である。また、LRRC15+ 筋線維芽細胞の発達とそれらの抗腫瘍免疫への直接的な影響を促進する細胞および分子シグナルの生体内での実証も欠けています。

最近の scRNA-seq 研究では、腫瘍形成中の活性 TGFβ シグナル伝達と LRRC15+ 筋線維芽細胞形成との関連付けにインシリコ予測が使用されています 1,3。別の単一細胞アトラス研究では、混乱した組織内の活性化された線維芽細胞サブセットが組織全体の普遍的な線維芽細胞から発生すると推論されています10。我々は、これら 2 つの推論間の in vivo での遺伝的関連性を明らかにすることを目的とし、普遍的な線維芽細胞における TGFβ シグナル伝達が腫瘍進行中の LRRC15+ 筋線維芽細胞の形成に不可欠であることを提案しました。我々は、普遍的な線維芽細胞をマークする細胞外マトリックスタンパク質であるデルマトポンチン（DPT）を標的とするマウスシステムを使用しました10。 DptIresCreERT2 マウスを TGFβ 受容体タイプ 2 (TGFβR2、Tgfbr2 によってコードされる) floxed マウス (DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl) と交配して、DPT+ ユニバーサル線維芽細胞において Tgfbr2 の誘導性および条件付きノックアウトを生成しました (図 1a、上)。 Dptwt/wtTgfbr2fl/fl (コントロール) または Dptki/kiTgfbr2fl/fl (Dpt コンディショナルノックアウト) マウスにタモキシフェン (TAM) レジメンを投与し、KPR3070 (KPR; KrasLSL.G12D/wt;p16/p19fl/wt; p53LSL.R270H/wt;Pdx1.Cre) PDAC 腫瘍細胞 1,11。フローサイトメトリー分析のために、移植の21日後に腫瘍を収集しました（図1a、下）。 Tgfbr2 の効率的なノックアウトを確実にするために、皮下 KPR 腫瘍を有する DptIresCreERT2Rosa26LSLYFP レポーターマウス 10 で同じ TAM レジメン (図 1a に概要を示す) を最初に実行しました。これは、腫瘍線維芽細胞のどのくらいの割合が、ナイーブ皮膚組織に豊富に存在する線維芽細胞集団である DPT+ 細胞に由来するかを理解するために行われました 10。移植から 21 日後、腫瘍内の PDPN+ 線維芽細胞のほとんど (約 84%) が YFP+ でした (拡張データ図 1a)。次に、Dptki/kiTgfbr2fl/fl 腫瘍由来の PDPN+ CAF 上の TGFβR2 発現は、Dptwt/wtTgfbr2fl/fl 腫瘍と比較して約 90% 減少しました (拡張データ図 1b)。その結果、Dptki/kiTgfbr2fl/fl 腫瘍では、対照の Dptwt/wtTgfbr2fl/fl 腫瘍と比較して、LRRC15+PDPN+ CAF の総数が大幅に減少しており、LRRC15+ 細胞がその形成において DPT+ 細胞における TGFβR2 シグナル伝達に依存していることが示されました（図 2）。 1b、c）。 Dptki/kiTgfbr2fl/fl 腫瘍における LRRC15+ 細胞の大幅な減少にもかかわらず、PDPN+CD31- 線維芽細胞の総数は両グループ間で変化せず、これは CAF コンパートメントを維持するために代償機構が起こっていることを示しました（図 1d）。

a、DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl マウスを作製するための遺伝的アプローチ (上) および実験的アプローチ (下) の概略図。 sc、皮下。 b〜g、データは、Dptwt / wtTgfbr2fl / flおよびDptki / kiTgfbr2fl / flマウスへの移植後21日目の皮下KPR腫瘍からのものです。 b、PDPN+LRRC15+細胞の頻度を示す代表的なフローサイトメトリープロット。細胞は PDPN+CD31- 細胞でゲートされました。 c、d、腫瘍重量によって正規化されたPDPN + LRRC15 + 細胞（c）およびPDPN + CD31 – 細胞（d）の総数の定量化（n = 12マウス）。 e、クラスターメンバーシップによって色付けされた6,525個の単一線維芽細胞の均一多様体近似および投影（UMAP）プロット（左、グループあたりn = 5マウス）およびUMAPからのクラスター（C0〜C5）内の示されたマーカー遺伝子の相対平均発現（右））。 f、e と同様の UMAP を遺伝子型ごとに分割。 g、eと同様のUMAPは遺伝子型ごとに分割され、Lrrc15の発現によって色分けされます。 h〜j、データは、Dptwt / wtTgfbr2fl / flまたはDptki / kiTgfbr2fl / flマウスへの移植後15日の同所性膵臓KPR腫瘍からのものです h、PDPN + LRRC15 + 細胞の頻度を示す代表的なフローサイトメトリープロット。細胞は PDPN+CD31- 細胞でゲートされました。 i、j、腫瘍重量によって正規化されたPDPN+LRRC15+細胞（i）およびPDPN+CD31-細胞（j）の総数の定量化（n = 11または14マウス）。 k、ヒトサンプルの収集スキーム。 NAT、正常な隣接組織。 BLAD、膀胱尿路上皮癌。 GYN、婦人科腫瘍。 PDAC、膵管腺癌。 HNSC、頭頸部扁平上皮癌。 SRC、肉腫。 KID、腎臓がん。 HEP、肝臓肝細胞癌。 CRC、結腸直腸がん。肺、肺がん。 MEL、黒色腫。 ADR、副腎がん。 PNET、膵臓神経内分泌腫瘍。 GALL、胆嚢がん。 l、間質細胞サンプルのPCA。形状はサンプルの起源を示します。色はがんの兆候を表します。 m、lからのPC1の遺伝子負荷。 n、lからPC1にわたる指定された適応症からのサンプルの分布。 o、サンプル全体にわたるLRRC15発現とTGFβ経路活性の間のピアソン相関係数(PCC)(黒丸)。線形回帰直線 (破線)。ｐ、特定のＴＣＧＡ適応症にわたるＴＧＦβ ＣＡＦの全生存ハザード比（ＨＲ）を示すフォレストプロット。 c、d、i、および j のデータは平均 ± sd です。 c、d、i、および j のデータは 2 つまたは 3 つの独立した実験からプールされます。 n の場合、ひげは最小値と最大値を表し、ボックスは四分位範囲を表し、中心線は中央値を表します。 p の場合、中心点は HR を示し、線は 95% 信頼区間 (CI) を表します。統計量は、両側対応のないスチューデントの t 検定 (c、d、i、j) またはコックス比例ハザード回帰モデル (p) を使用して計算されました。

ソースデータ

Dptki/kiTgfbr2fl/fl 腫瘍における LRRC15+ CAF 形成の非存在下での総線維芽細胞含有量の維持は、これらのマウスにおける線維芽細胞組成のより深い調査を保証するものでした。 scRNA-seq は、Dptwt/wtTgfbr2fl/fl 腫瘍と Dptki/kiTgfbr2fl/fl 腫瘍の両方に由来する CD24–CD45– 間質細胞および CD45+ 免疫細胞に対して実行されました (拡張データ図 1c)。品質管理、次元削減、およびクラスター化の後、4 つの主要なグループにの細胞が同定され、それぞれが複数の動物からの細胞で表されました（拡張データ図 1d）。これらは、免疫細胞 (Ptprc+、Cd45+ としても知られる)、内皮細胞 (Pecam1+、Cd31+ としても知られる)、周皮細胞 (Rgs5+) および線維芽細胞 (Lum+) でした (補足表 1)。下流の分析を線維芽細胞に焦点を当てたところ、6つのCAF特異的クラスターが明らかになりました（図1eおよび補足表2）。普遍的な線維芽細胞マーカーを強く発現したPi16+クラスター（クラスター3）。 Cxcl12+ クラスター (クラスター 2)。 Crabp1+ CAF のクラスター (クラスター 1)。増殖マーカーを高度に発現したクラスター (クラスター 4)。そして、Lrrc15発現が高い（クラスター0）および低い（クラスター5）2つのクラスター（図1e）。クラスター 0 および 5 は、Acta2 や Tagln などの TGFβ シグナル伝達を示す、Lrrc15 を超える追加の筋線維芽細胞マーカーを発現しました。これら 2 つのクラスターは、PDAC1 の遺伝子操作マウスモデル (GEMM) から以前に推定された Tgfb CAF 遺伝子サインでも高いスコアを獲得しました (拡張データ図 1e)。 DPT+細胞におけるTGFβR2シグナル伝達がLRRC15+CAFの発達に必要であるという我々の仮説を裏付けるものとして、クラスター5とクラスター0の両方がDptki/kiTgfbr2fl/flマウスには存在しなかった（図1f）。さらに、Dptki/kiTgfbr2fl/fl動物には、Lrrc15、Acta2、またはTaglnを発現する細胞がほとんどありませんでした（図1gおよび拡張データ図1f）。 LRRC15+ CAF の欠如により、Dptki/kiTgfbr2fl/fl マウスにおける Pi16+ ユニバーサル線維芽細胞クラスター 3 および Crabp1+ クラスター 1 の相対存在量が同時に増加しました。この結果は、LRRC15+ CAFの発達がない場合には腫瘍線維芽細胞の総含有量が補償されるという我々の発見を裏付けるものです（拡張データ図1g、h）。増殖クラスター 4 の相対存在量に有意な変化は観察されませんでしたが、Dptki/kiTgfbr2fl/fl マウスの増殖細胞の Tgfb CAF PDAC GEMM シグネチャのスコアは低くなりました。対照的に、Dptwt/wtTgfbr2fl/fl動物からの細胞は、このサインに関して高いスコアを示しました。これは、DPT +ユニバーサル線維芽細胞からのLRRC15 + CAF形成がTGFβR2に依存するという我々の発見と一致しています（拡張データ図1i）。

次に、定常状態で同様に豊富な DPT+ ユニバーサル線維芽細胞を持つ組織部位である膵臓での LRRC15+ CAF 発生に同じ経路の活性化が必要かどうかを尋ねました 10。 KPR腫瘍細胞をDptwt/wtTgfbr2fl/flまたはDptki/kiTgfbr2fl/flマウスの膵臓に同所移植し、15日後に腫瘍を分析しました（図1a、下）。皮下 KPR 腫瘍と同様に、同所性膵臓腫瘍における LRRC15+PDPN+ CAF の発達は、対照 Dptwt/wtTgfbr2fl/fl マウスと比較して Dptki/kiTgfbr2fl/fl マウスで著しく損なわれていましたが、PDPN+CD31- 線維芽細胞の総数は変化しませんでした (図.1h–j）。

これらのデータは、DPT+ ユニバーサル線維芽細胞から LRRC15+ 筋線維芽細胞への分化には TGFβ シグナル伝達が必要であるという直接的な in vivo 証拠を提供します。 LRRC15+ CAF の発達を鈍化させると、DPT+ ユニバーサル線維芽細胞と TGFβR2 非依存性 CAF が蓄積され、それらが存在しない場合でも CAF コンパートメントが維持されました。重要なことに、この系統関係とシグナル伝達依存性は複数の組織部位で必要であり、これは DPT+ 線維芽細胞の普遍的な性質を裏付けています。

次に、我々は、ユニバーサル線維芽細胞と LRRC15+ 筋線維芽細胞の間の軸がヒトの癌の線維芽細胞コンパートメントを代表しているかどうかを理解することを目的としました。以前の研究 1 は、The Cancer Genome Atlas (TCGA) からの全腫瘍サンプルのバルク RNA-seq データのデコンボリューションに依存して、適応症全体にわたる特定の CAF サブセットの存在量を推測していました。ヒトのがんの種類にわたる線維芽細胞コンパートメント内の不均一性に特に焦点を当てるために、13の適応症にわたる159人の患者サンプルからCD45〜CD44+CD90+間質細胞を分類し（図1kおよび補足表3）、バルクRNA-seq発現プロファイルを生成しました。主成分分析（PCA）と階層的クラスタリングに基づいて高純度サンプルをフィルタリングすることにより、ヒトCAF発現プログラムとその汎がん罹患率を公平に観察することが可能になりました（拡張データ図2a）。 PCA空間ではがんの兆候が明確に分離されていることは観察されず、汎がん間質細胞のサインが2つの第一主成分（PC）を駆動していることが示唆されました（図1l）。 PC1 について最も強い正の重みを持つ遺伝子には、COL10A1、COL11A1、MMP11、LRRC15 などの既知の LRRC15+ CAF 発現マーカー遺伝子が含まれていました (参考文献 1)。逆に、CD34やPI16などの以前に記載された普遍的な線維芽細胞に関連するマーカーは、PC1に対して最も強い負の重みを持っていました（参考文献10）（図1m）。一貫して、正常な隣接組織から得られたサンプルは、ほとんどが負の PC1 値を示しました (拡張データ図 2b)。分析された適応症の中で、膵臓がんと膀胱がんのサンプルの PC1 値が最も高く、LRRC15+ CAF が高度に濃縮されていることを示しました (図 1n)。膵臓がんにおける LRRC15+ CAF レベルが高い傾向は、独立したデータセットで確認されました (拡張データ図 2c)。経路濃縮分析により、高レベルのLRRC15発現を示すサンプルではTGFβ経路活性化の増加が示されたことが明らかになり、それによって、我々のマウスモデルで遺伝的に実証されたように、ヒトにおけるLRRC15+ CAF発現プログラムも同様にTGFβシグナル伝達によって駆動されることが強く示唆されました（図1o）。 TGFβ CAF マーカーの高発現レベルは、TCGA のすべての適応症のサンプル全体、および膀胱がんや膵臓がんを含む特定の腫瘍タイプ内での生存率の低下と有意に関連していました（図 1p および拡張データ図 2d）。これらのヒトデータは、ユニバーサル線維芽細胞とLRRC15+筋線維芽細胞によって定義されるヒトのがん全体にわたるCAF不均一性の中心軸を明らかにしており、LRRC15+ CAFが豊富な兆候ではTGFβシグナル伝達が豊富である。

我々の遺伝子マウスシステムの結果と合わせて、これらの発見は、TGFβシグナル伝達が万能線維芽細胞とLRRC15+筋線維芽細胞の間の腫瘍線維芽細胞の設定値を決定する加減抵抗器として機能し、患者の転帰の潜在的な予測因子として機能する可能性があることを示唆している。

腫瘍増殖および抗腫瘍免疫に対する LRRC15+ CAF の影響を調査するために、ジフテリア毒素受容体 (DTR) – GFP カセットを Lrrc15 の開始コドンの下流のエクソン 2 にノックした遺伝子マウスモデルを作成しました (Lrrc15DTRGFP ノックマウスで）。このモデルにより、ジフテリア毒素（DT）の投与後のLRRC15発現細胞の制御された枯渇が可能になりました（図2a、上）。このアプローチが CAF のこの部分集団の選択的除去を提供することを確認するために、マウスでの LRRC15 発現を評価しました。 KPR腫瘍内では、LRRC15発現はPDPN+線維芽細胞に限定されており、他の区画にはほとんど存在しませんでした（拡張データ図3a）。腫瘍の外側、in situ ハイブリダイゼーションおよびバルク RNA-seq12 分析により、Lrrc15 発現が複数の組織にわたって低いか存在しないことが示されました (拡張データ図 3b、c)。同様の結果がヒトの腫瘍および末梢組織でも報告されています13。

a、Lrrc15DTRGFP マウスの遺伝的アプローチ (上) と実験的アプローチ (下) の概略図。 b〜e、データは、DTR-およびDTR+マウスのDT治療8日後の皮下KPR腫瘍からのものです。 b、PDPN+LRRC15+細胞の頻度を示す代表的なフローサイトメトリープロット。細胞は、CD24–CD45– 細胞 (左) または PDPN+CD31– 細胞 (右) でゲートされました。 c、d、腫瘍重量によって正規化されたPDPN + LRRC15 + 細胞（c）およびPDPN + CD31 – 細胞（d）の総数の定量化（n = 12または14マウス）。 e、LRRC15およびDAPIの代表的な免疫蛍光画像。スケールバー、250 μm。 f、DTで処置したDTR-マウスおよびDTR+マウスの腫瘍増殖曲線（1グループあたりn = 9または11マウス）。左：全動物の平均腫瘍体積（*P = 0.015、***P = 0.0006、****P < 0.0001）。中央と右: 遺伝子型ごとの個々の動物の成長曲線。 x 軸は DT 治療後の日数を表します。赤い破線は、コントロール (Ctrl) グループの平均参照適合度を表します。 c と d のデータは 4 つの独立した実験からプールされたものです。 e と f のデータは 2 つまたは 3 つの独立した実験の代表です。 c、d、f のデータは平均 ± sd です。統計量は、両側対応のないスチューデント t 検定 (c および d) または通常の二元配置分散分析 (f) を使用して計算されました。

ソースデータ

以前のCAF枯渇戦略では、α平滑筋アクチン（αSMA、Acta2によってコードされる）や線維芽細胞活性化タンパク質（FAP、Fapによってコードされる）などのマーカーが使用されてきたため、FapおよびActa2の発現レベルをLrrc15と比較しました。 KPR腫瘍では、Lrrc15の発現は線維芽細胞に限定されていましたが、Acta2およびFapの発現は線維芽細胞と周皮細胞の両方で観察されました（拡張データ図3d）。腫瘍を超えて、FapとActa2の両方の発現が複数の組織にわたる間質細胞で観察されましたが、Lrrc15は存在しませんでした（拡張データ図3e）。マウスの皮膚流入リンパ節 (LN) では、周皮細胞で Acta2 が高度に発現しており、Fap と Acta2 の発現は両方とも Ccl19+ 線維芽細胞網様細胞と顕著に重複していました。対照的に、Lrrc15は、LN線維芽細胞網様細胞または周皮細胞では検出できませんでした16（拡張データ図3f）。まとめると、これらのデータは、LRRC15 が腫瘍内外の他の細胞と重複しない TGFβ 駆動型 CAF の正真正銘のマーカーであることを示しています。

Lrrc15 発現の特異性を考慮して、LRRC15+ CAF を選択的に枯渇させることが腫瘍増殖に与える影響の評価を進めました。 KPR 腫瘍を Lrrc15DTRGFPwt/wt (DTR-) または Lrrc15DTRGFPwt/ki (DTR+) マウスの皮下に移植し、腫瘍が平均体積 100 ～ 200 mm3 に達した時点 (移植後約 10 日) で両グループのマウスで DT 治療を開始しました。 (図2a、下)。 8日後、腫瘍を収集し、LRRC15+ CAFの存在を評価しました。 DT治療されたDTR-マウスの腫瘍にはLRRC15+ CAFの主な集団が含まれていましたが、DTR+腫瘍におけるDT治療は総LRRC15+細胞の約98％の損失をもたらしました（図2b、c）。重要なことに、DTR + マウスにおけるLRRC15 + CAFの損失はDT治療に特異的であり、DTの非存在下でのこれらの細胞の不十分な発達の結果ではありませんでした（拡張データ図4a、b）。 PDPN+ 線維芽細胞の総数も、DT 治療 DTR+ マウスでは約 70% 大幅に減少しました (図 2d)。免疫蛍光イメージングによりこれらの結果が確認され、DTR+腫瘍ではLRRC15染色が存在しないことが示されました（図2e）。 DT投与を継続すると、8日目以降も大幅なLRRC15 + CAF枯渇とPDPN +線維芽細胞コンパートメントの減少が持続し、どちらのマウスグループでも有意な体重変化は引き起こされませんでした（拡張データ図4c、d）。その結果、DTR+ マウスでは LRRC15+ CAF を持続的に枯渇させると、DTR- 対照マウスと比較して腫瘍の増殖が大幅に遅くなりました（図 2f）。まとめると、これらのデータは、腫瘍内の CAF の LRRC15+ サブタイプを選択的に除去すると、総 CAF 含有量が大幅に減少し、腫瘍量が顕著かつ持続的に減少することを示しています。

LRRC15+ CAF アブレーションが線維芽細胞コンパートメントに与える重大な影響により、我々は、CAF アブレーションが存在しない場合の残りの CAF 環境の組成を調査することになりました。 DTR- および DTR+ マウスの腫瘍由来の CD24-CD45- 間質細胞の scRNA-seq は、腫瘍移植後 10 日と DT 治療 (IOT) の開始直前 (0 日目) および 2 日目を含む 4 つの異なる時点で実施されました。 IOT 後の図 7、14、および 21 (図 3a および拡張データ図 5a、上)。 DT 治療は、すべてのマウスで 0 日目から 14 日目まで開始され、その後、研究の最後の 1 週間から 21 日目まで中止されました (図 3a)。さらに、未処理の非腫瘍皮膚組織由来のEPCAM-CD45-間質細胞は、腫瘍移植前のベースラインプロファイルを確立するために特徴づけられました（図3aおよび拡張データ図5a、下）。

a、実験スキーム（各時点およびグループあたり n = 5 匹のマウス）。 b、クラスターのメンバーシップによって色付けされた (左)、または起源の組織によって色付けされた (中央) 37,383 個の単一線維芽細胞の UMAP プロット。左 UMAP からのクラスター全体での示されたマーカー遺伝子の相対平均発現 (右)。 c、bと同様のUMAP。Pi16およびLrrc15の発現によって色付けされ、時点および条件によって分割されます。 d、腫瘍を有するサンプルにおける各時点および状態におけるLrrc15およびPi16の陽性線維芽細胞の割合（ドットサイズ）および相対平均発現（色）を視覚化するドットプロット。 e、腫瘍担持サンプルにおける4つの時点すべてにおける各治療グループのクラスター0内の細胞の割合（グループあたりn = 5匹のマウス）。 f、示された時点および条件ごとにプールされた細胞のPROGENy経路濃縮スコア（色）（下の行）。 e のデータは平均値 + sem であり、統計量は両側対応のないスチューデントの t 検定を使用して計算されました。

ソースデータ

品質管理の後、すべての時点および治療グループにわたって 54,240 個の単一間質細胞が分析されました。次元削減とクラスター化により、周皮細胞 (Rgs5+)、内皮細胞 (Pecam1+、Cd31+ としても知られる)、線維芽細胞 (Lum+) が 3 つの主要な間質細胞集団であることが明らかになりました (拡張データ図 5b、左と下、および補足表 4)。すべてのクラスターには複数の動物からの細胞が存在し、その後の分析は線維芽細胞に焦点を当てました（拡張データ図 5b、右、および補足表 5）。ナイーブ皮膚組織からの線維芽細胞は、腫瘍担持マウスからの細胞の混合がほとんどまたはまったくない状態で、2 つの別々のクラスター (クラスター 3 および 4) を形成しました (図 3b)。腫瘍を有する組織内では、線維芽細胞は 4 つの転写発現表現型に割り当てられる可能性があります。Lrrc15 クラスター (クラスター 0) は、Tagln や Spp1 などの筋線維芽細胞マーカーも発現します。増殖中のCAFのクラスター（クラスター5）。 Cxcl14 を発現する CAF のクラスター (クラスター 2)。そして、ユニバーサル線維芽細胞と発現パターンを共有するPi16high CAFのクラスター（クラスター1）10（図3b）。

次に、DT処理したDTR-およびDTR+マウスの線維芽細胞の動態をモニタリングし、各時点でのPi16とLrrc15の発現を比較しました（図3c）。ナイーブな非腫瘍皮膚では、Lrrc15 発現は存在せず、すべての細胞は均一に Pi16+ でした。この結果は、正常な膵臓組織線維芽細胞の表現型と類似した普遍的な線維芽細胞表現型を示しました1,10。腫瘍組織では、0 日目に Pi16+ 細胞と Lrrc15+ 細胞が検出されました。 DTR- 動物では、LRRC15 + CAF が、時間経過全体を通じて主要な CAF 集団として出現し、7 日目から始まり 21 日目まで持続しました（図 3c、d）。逆に、DTR + 動物では、Lrrc15 + 細胞はDT治療の最初の2週間に存在せず、それに伴いPi16 + 細胞の相対的な増加が観察され、そのサブセットはCxcl12も発現しました（図3c、dおよび拡張データ図5c）。）。 DT治療の中止から1週間後の21日目に、Lrrc15+細胞が再出現した(図3c、d)。これと同じパターンの Lrrc15 動態がクラスターレベルにも反映され、LRRC15+ CAF クラスター 0 からの細胞の頻度が増加し、DTR- 動物でも維持されました。対照的に、DTR + 動物では、DT 除去後の再出現前にクラスター 0 CAF が枯渇しました (図 3e)。腫瘍関連クラスター 1、2、および 5 の相対頻度も DTR+ 動物で増加しました (拡張データ図 5d)。クラスター 1、2、および 5 CAF による部分的に保持された Pi16 発現は、それらが正常組織線維芽細胞により近い状態にあることを示唆しました。この観察を裏付けるように、クラスター 1 と 2 は、クラスター 0 と 5 よりもクラスター 3 と 4 の正常皮膚線維芽細胞のサインに関してより高いスコアを付けました (拡張データ図 5e)。

PROGENy 経路活性分析 17 では、LRRC15+ CAF が存在するサンプルにおける高い TGFβ 活性が明らかになりました。対照的に、LRRC15 + CAFが枯渇したサンプルは、ナイーブ皮膚の線維芽細胞サンプルに最も類似しており、JAK-STAT、NF-κB、およびTNFシグナル伝達経路が豊富でした（図3f）。これは主に、最も高い TGFβ 活性を持ったクラスター 0 と比較して、クラスター 1 と 2 が正常組織線維芽細胞 (クラスター 3 と 4) と JAK-STAT、NF-κB、および TNF シグナル伝達経路を共有している、クラスター存在量の前述の変化によって主に説明されました。 (拡張データ図 5f)。まとめると、これらのデータは、LRRC15+ CAF の枯渇により、KPR 腫瘍における全体的な線維芽細胞含有量が減少するだけでなく、残りの CAF の設定値がより普遍的な線維芽細胞様の状態に向けて再調整されることを示しています。

最近の研究では、複数の種類のがんにおいて、LRRC15+ CAF シグネチャーの高発現と抗 PDL1 治療に対する反応の欠如との間の臨床的関連性が特定されました 1,2。ただし、LRRC15+ CAF がこの関連性の直接の原因であるかどうかはまだテストされていません。私たちは、LRRC15+ CAF の非存在下では T 細胞免疫と ICB 応答性が影響を受けると提案し、これを前臨床モデルでテストしました。まず、LRRC15+ CAF 切除後に観察される腫瘍制御の改善が CD8+ T 細胞に依存するかどうかを確認しました。この目的を達成するために、皮下に KPR 腫瘍を有し、DT で治療された DTR- および DTR+ マウスにも、CD8 枯渇抗体またはアイソタイプ対照抗体を投与しました。治療期間中、腫瘍の増殖をモニタリングしました (図 4a)。 LRRC15+ CAFが枯渇したマウスは、十分なLRRC15+ CAFを有するマウスと比較して腫瘍量の有意な減少を示した（図4bおよび拡張データ図6a）。 CD8 T細胞の枯渇はこの効果を逆転させ、LRRC15+ CAFの非存在下でCD8 + T細胞が腫瘍量を軽減する役割があることを示しました（図4bおよび拡張データ図6a）。

a、b、データは、DT および CD8 枯渇抗体で治療した皮下 KPR 腫瘍を有する DTR- および DTR+ マウスからのものです。 a、実験計画。 b、平均腫瘍増殖曲線（各グループあたり n = 10 匹のマウス; *** P = 0.0002、**** P < 0.0001）。 c〜e、DTR-およびDTR+マウスのDT治療後12日目の皮下KPR腫瘍分析。 c、腫瘍重量によって正規化されたCD8+ T細胞の定量化(n = 10マウス)。 d、CD8 + PD1 + T細胞上のTIM3、LAG3、およびCD39の平均蛍光強度（MFI）の定量化（n = 5マウス）。 e, TNF+ および IFNγ+ CD8+ T 細胞の頻度の定量化 (n = 10 マウス)。 f、単独または分類されたCAFとともに72時間培養した後の抗CD3および抗CD28活性化CD8+ T細胞のTNF+およびIFNγ+の頻度の定量化（L15、LRRC15; n = 4サンプル）。 g – j、データは、DTおよび抗PDL1抗体で治療された皮下KPR腫瘍を有するDTR–およびDTR+マウスからのものです。 g, 実験計画。 h、平均腫瘍増殖曲線（n = 1グループあたり9または10匹のマウス; ****P < 0.0001）。 i、j、グランザイムB+ CD8+ T細胞（n = 10マウス）（i）およびTNF+IFNγ+グランザイムB+ CD8+ T細胞（n = 10マウス）（j）の頻度の定量化を示す、治療12日後の皮下KPR腫瘍分析。。 k – m、データは、DTおよび抗PDL1抗体で治療された同所性膵臓KPR腫瘍を有するDTR–およびDTR+マウスからのもの k、実験スキーム。 l、平均腫瘍増殖曲線（n = 1グループあたり7匹のマウス）。 x 軸は移植後の日数を表します。 m、移植後 24 日目の腫瘍重量 (n = 5 マウス)。 b – f、h – j、l および m のデータは平均値 ± sd です。b、h、d および f のデータは 2 つの独立した実験を表し、l と m は 1 つの独立した実験を表します。 c、e、I、および j のデータは、2 つの独立した実験からプールされています。統計量は、通常の一元配置分散分析検定 (b、f、h – j、l、m) または両側対応のないスチューデント t 検定 (c、d、e) を使用して計算されました。有意値は、他の 3 つのグループと比較して、b の DTR+ + アイソタイプグループと h の DTR+ + 抗 PDL1 グループをマークします。

ソースデータ

T 細胞機能に対する LRRC15+ CAF 枯渇の薬力学的影響を理解するために、フローサイトメトリーを使用して、CAF 枯渇から 12 日後の腫瘍内 CD8+ T 細胞コンパートメントを特徴付けました。 LRRC15+ CAF十分腫瘍とCAF欠損腫瘍の間で腫瘍内CD8+ T細胞の総数に差は観察されなかった（図4c）。しかし、LRRC15 + CAFの非存在下では、PD1 + CD8 + T細胞は、TIM3、LAG3、CD39を含む、T細胞の枯渇と機能不全に関連する分子の表面マーカー発現の大幅な低下を示しました18、19（図4d）。さらに、TNFおよびIFNγの発現増加によって示されるように、CD8+ T細胞機能の増強が観察されました（図4e）。

KPR腫瘍の免疫蛍光分析により、かなりの割合の腫瘍浸潤CD8+ T細胞がLRRC15+ CAFに近接していることが明らかになり、直接的な細胞間相互作用が起こっていることが示唆されました（拡張データ図6b）。このことから、LRRC15+ CAF がエフェクター T 細胞の電位に直接影響を与えることができるかどうかという疑問が生じました。 DTR- 腫瘍由来の LRRC15+ および LRRC15- CAF、または DTR+ 腫瘍由来の PDPN+ LRRC15 欠乏 CAF を、DT 治療の 12 日後に選別しました。次に、これらを抗CD3抗体および抗CD28抗体の存在下で脾臓CD8+ T細胞と個別に共培養しました（拡張データ図6c、d）。 3日後、CD8+ T細胞を再刺激し、TNFおよびIFNγタンパク質の発現を評価しました。 CD8 + T細胞単独と比較して、TNFおよびIFNγの発現はLRRC15 + CAFの存在下で大幅に減少しましたが、T細胞機能はLRRC15 – CAFまたは正規化されたLRRC15枯渇CAFの存在下では変化しませんでした（図4f）。これらの結果は、腫瘍内 CD8+ T 細胞機能の抑制における LRRC15+ CAF の役割を実証し、LRRC15+ CAF が CD8+ T 細胞エフェクターの可能性を直接制限できることを示しています。

これまでの研究では、がんモデルにおける FAP+ 筋線維芽細胞の枯渇により抗 PDL1 応答性が改善されることが示されています 20。我々は、LRRC15+ CAF アブレーション後に同様の効果が観察されるかどうかをテストしたいと考えました。皮下にKPR腫瘍を持ち、DTで治療されたDTR-およびDTR+マウスに抗PDL1またはアイソタイプ対照抗体を与え、腫瘍の増殖を評価しました（図4g）。 LRRC15+ CAF 十分マウスは、腫瘍量の部分的な減少によって実証されるように、抗 PDL1 治療に対してある程度の感受性を示しました。逆に、抗ＰＤＬ１治療に対する反応性は、腫瘍量のより実質的な減少に反映されるように、ＬＲＲＣ１５＋ＣＡＦ枯渇マウスにおいて有意に増強された。 (図 4h および拡張データ図 6e)。この組み合わせ設定は、腫瘍制御を改善するだけでなく、腫瘍の進行までの時間によって測定されるように、有意な生存利益にもつながりました（拡張データ図6f）。 LRRC15+ CAF 枯渇による抗 PDL1 処理から 12 日後の CD8+ T 細胞コンパートメントのフローサイトメトリー分析により、グランザイム B 発現によって測定される細胞溶解能の増加が明らかになりました。 TNF + IFNγ + グランザイム B + CD8 + T 細胞の数に反映されるように、多機能性 T 細胞の頻度も増加しました (図 4i、j)。

次に、LRRC15+ CAF が存在しないことで、膵臓で増殖した KPR 腫瘍における抗 PDL1 治療に対する反応性が改善するかどうかを調べました。 KPR 腫瘍細胞を DTR- または DTR+ マウスの膵臓に同所的に移植しました。移植後 7 日目に、抗 PDL1 抗体またはアイソタイプ対照と組み合わせた DT 治療を開始し、腫瘍量を超音波イメージングによって測定しました (図 4k および拡張データ図 7a)。皮下腫瘍と同様に、同所性膵臓腫瘍におけるLRRC15+ CAFのアブレーションは腫瘍制御を大幅に改善し、抗PDL1と相乗して腫瘍量をさらに軽減しました（図4lおよび拡張データ図7b）。抗ＰＤＬ１で処置したＤＴＲ＋マウスから２４日目に採取した腫瘍は、対照マウスよりも有意に低い腫瘍重量を示し、これは処置中に観察された腫瘍体積動態を反映していた（図４ｍ）。さらに、DTR+膵臓腫瘍は、抗PDL1またはアイソタイプ対照のどちらで処理しても、LRRC15+ CAFのほぼ完全な除去と総PDPN+線維芽細胞コンパートメントの大幅な減少を示しました（拡張データ図7c〜e）。まとめると、これらの発見は、膵臓腫瘍微小環境からの LRRC15+ CAF の治療的除去が、抗 PDL1 ICB 治療に対する反応性の顕著な改善につながることを示しています。

この研究では、DPT+ユニバーサル線維芽細胞におけるTGFβシグナル伝達が腫瘍形成中のLRRC15+筋線維芽細胞形成を促進し、複数のヒト癌において線維芽細胞の中心軸を構成するという直接的な遺伝的証拠を提供した。 LRRC15+ CAF を選択的に枯渇させると、総線維芽細胞含有量が著しく減少し、この間質区画が普遍的な線維芽細胞様の状態に戻りました。次に、これにより腫瘍内の CD8+ T 細胞エフェクター機能が強化され、抗 PDL1 応答性が強化されました。

この筋線維芽細胞サブセットの高度に制限されたマーカーとしての LRRC15 の有用性により、LN などの他の組織の線維芽細胞を乱すことなく、TME の形成における LRRC15 の役割を直接調査することができました。LN では、組織構造や T 細胞のプライミングと機能が局所的な線維芽細胞によって形成されます。ネットワーク16、21。 LRRC15+ CAF枯渇腫瘍の分析により、普遍的な線維芽細胞様活性が強化されているが、持続的な切除を行わなくても、LRRC15+ 筋線維芽細胞がCAFコンパートメントに補充して足場を再確立できることが明らかになった。これらのデータは、最終的に抗腫瘍 T 細胞免疫と ICB 療法の有効性を抑制する腫瘍線維芽細胞の設定値を確立するために、LRRC15+ CAF がユニバーサル線維芽細胞と持つ「プッシュアンドプル」関係を強調しています。免疫学的には、CD8+ T 細胞と LRRC15+ CAF の機能抑制につながる関係の性質を理解するには、さらなる研究が必要です。さらに、LRRC15+ CAF がさまざまな適応症や腫瘍免疫表現型にわたって同様に ICB 応答性を決定するかどうかを理解することが重要です。

治療的には、我々の発見は、LRRC15+ CAF活性を調節するための最適な戦略の問題を提起する。 TGFβ 阻害剤の使用は現在複数の臨床試験 22 で評価されており、LRRC15+ CAF 形成を阻害するための魅力的な治療選択肢です。しかし、DPT+ 前駆体における TGFβ シグナル伝達の除去により、総線維芽細胞数を維持するための代償機構が可能になりました。逆に、LRRC15+ CAF アブレーションは、TME における線維芽細胞の細胞性を著しく減少させました。効果的な抗腫瘍免疫応答のための最適な環境が、より小さく、LRRC15+ CAF を含まない CAF コンパートメントを必要とする場合、我々のデータは、LRRC15+ CAF 自体を枯渇させることが、癌に対する強力で持続的な応答を生成するためのより魅力的な治療戦略である可能性を強く示唆しています。免疫療法。さらに、特発性肺線維症や潰瘍性大腸炎などの他の非腫瘍性疾患における LRRC15+ 筋線維芽細胞の存在は、そのような治療アプローチが他の疾患領域で患者に利益をもたらすために拡大される可能性があることを示唆しています。

DptIresCreERT2 マウス 10 および Lrrc15DTRGFP マウスは、Genentech で設計、生成、飼育されました。 Tgfbr2fl/fl マウス (012603) は、Jackson Laboratory から入手しました。すべての研究には、年齢と性別を一致させたマウス (6 ～ 12 週齢) を使用しました。マウスは、米国国立衛生研究所のガイドラインを使用して、病原体のない特定の条件下で維持されました。各研究のサンプルサイズは図の凡例に記載されています。すべての実験は、Genentech の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールに従って実行されました。

相同組換えとマウス胚性幹 (ES) 細胞技術 23,24,25 を使用して、Lrrc15 DTR-GFP がノックインされた遺伝子改変マウス系統を作製しました。ジーンターゲティングベクターは、GRCm38/mm10 染色体 16: 30,274,520 ～ 30,276,223 に対応する 1,704 bp の相同性 5 ' アームと、染色体 16: 30,270,786 ～ 30,272,779 に対応する 1,994 bp の 3' 相同性アームで構築されました。 ATG 後のエクソン 2 の欠失は、染色体 16: 30,272,780 ～ 30,274,516 に対応します。 DTR-EGFP-SV40-FRT-PGK-neo-FRT は、エクソン 2 の ATG の直後に挿入されました。最終的なベクターは DNA シークエンシングによって確認され、線形化され、標準的な方法 (G418+ および G418+ および C2 (C57BL/6N) ES 細胞を標的とするために使用されました)ガンシクロビル選択）26 C57BL/6N C2 ES 細胞 27 に 20 µg の線状化ターゲティングベクター DNA をエレクトロポレーションし、基本的に前述したとおり薬物選択下で培養しました 28。ロングレンジ PCR とそれに続く配列確認を使用して陽性クローンを同定しました。正しく標的化された ES 細胞を核型分析に供しました。正倍体遺伝子を標的とした ES 細胞クローンをアデノ FLP で処理して PGK ネオマイシンを除去し、ES 細胞クローンをテストして PGK ネオマイシンカセットのコピーを持たないクローンを同定し、標的対立遺伝子の正しい配列が検証されました。 Y染色体の存在は、アルビノB1/6N胚へのマイクロインジェクションの前に検証された。生殖系列伝達は、得られたキメラをC57BL/6N雌と交配した後に得られた。マウスのコロニーを拡大する前に、子犬のゲノム DNA をロングレンジ PCR でスクリーニングして、目的の遺伝子標的構造を確認しました。ジェノタイピングには、以下のプライマーを使用しました:5'-AGGCGAGGCGATTG-3'、5'-CGATGAGGGCTGAAATGT-3'、および 5'-TGGTCCGTGGATACAGT-3' は、408 bp の野生型 DNA フラグメントおよび 313 bp のノックイン DNA フラグメントを増幅しました。次の PCR サイクルを使用しました。94 °C で 4 分間、(94 °C で 1 分間、55 °C で 30 秒間、72 °C で 1 分間) を 30 サイクル。 72℃で10分間。 4 °C 無限。

KPR マウス膵臓腺癌細胞株は、Genentech の Junttila Group によって KPR PDAC GEMM (KrasLSL.G12D/wt;p16/p19fl/wt;p53LSL.R270H/wt;Pdx1.Cre)11 から生成されました。 KPR 細胞は、10% FBS (Hyclone) と 2 mmol l-1 l-グルタミンを含む RPMI で培養されました。すべての細胞株は、定量的 PCR (Lonza Mycoalert および Stratagene Mycosensor) によってマイコプラズマ汚染についてテストされました。注入されたすべての腫瘍について、細胞は最初の 3 継代以内に使用されました。

皮下 KPR 腫瘍の場合、KPR 細胞をトリプシン処理、濾過、計数し、ハンクス緩衝食塩水とフェノールレッドを含まないマトリゲル (Corning) の 1:1 混合物に 1 × 106 細胞 ml-1 の濃度で再懸濁しました。使用したすべての遺伝子型のマウスについて、年齢と性別を一致させた 6 ～ 12 週齢のマウスの右側腹部に 1 × 105 個の KPR 腫瘍細胞を皮下接種しました。移植前に側腹部の皮膚の毛を剃った。腫瘍体積は、次の修正楕円体公式: 1/2 × (長さ × 幅 2) を使用して、週に 2 ～ 3 回測定および計算されました。 >1,000 mm3 の腫瘍は進行しているとみなされ、動物は研究から除外されました。同様に、腫瘍が5 mmを超えて潰瘍化した動物は研究から除外された。 Lrrc15DTRGFP マウスの皮下腫瘍研究では、腫瘍の体積が 100 ～ 200 mm3 に達したとき（接種から約 10 日後）、動物を腫瘍体積に基づいて治療グループに分配し、治療を開始しました。

同所性膵臓 KPR 腫瘍の場合、マウスの膵臓への膵臓腫瘍細胞の注射は、以前に記載されているように実行されました 29。 KPR 細胞を、ハンクス緩衝食塩水とフェノールレッドを含まないマトリゲル (Corning) の 1:1 混合液に 2 × 105 または 2 × 106 細胞 ml-1 の濃度で再懸濁しました。 DptCreERT2Tgfbr2fl/fl または Lrrc15DTR マウスを吸入麻酔で麻酔し、加熱パッド上に置き、点眼ゲルを与えました。左側腹部または腹部領域の毛を剃り、ChloraPrep (BD) を使用して滅菌した後、脾臓のシルエットの内側に滅菌マイクロハサミで約 1 cm の切開を加えました。下にある筋肉層を切開し、先が鈍い鉗子を使用して膵臓と脾臓を外に出しました。細胞溶液を含む準備した 31 ゲージの針を膵臓尾部に挿入し、1 × 105 細胞を含む溶液 50 μl をゆっくりと注入しました。吸収性縫合糸と創傷クリップを使用して創傷を閉じ、マウスを回復させた。すべての動物には、徐放性鎮痛剤ブプレノルフィン SR LAB 0.5 mg kg-1 が投与されました。外科的処置後、感染または苦痛の兆候がないかマウスを毎日監視した。 Lrrc15DTRGFP マウスにおける同所性腫瘍の研究では、移植の 7 日後に動物を腫瘍体積に基づいて治療グループに分配し、治療を開始しました。

マウスは、分析のために治療後の指定された時点で収集されるか、または腫瘍増殖研究のために使用されました。マウス研究におけるサンプルサイズは、研究グループ内の変動に基づいて統計的有意性を確立するために日常的に必要なマウスの数に基づいていました。可能な場合には治療群を盲検化した。ここでのすべての動物研究は、Genentech Institutional Animal Care and Use Committee によって承認されました。

Lrrc15DTRGFP マウスにおける同所性膵臓腫瘍の研究では、超音波イメージングによって腫瘍体積を測定しました。マウスは温かい誘導ボックス内で 4% セボフルラン (Zoetis) で麻酔され、イメージング中は 2.5 ～ 3% セボフルランの連続流下で右側に配置されました。脱毛後、超音波カップリングゲルを皮膚に置き、解剖学的Bモード画像をvevo2100（Fujifilm VisualSonics）で横断面および縦面で取得し、腫瘍の最大断面を捕捉しました（MS-550Dプローブ、中心周波数）。 40 MHz、軸方向解像度 40 μm、横方向解像度 90 μm、被写界深度 12 mm)。マウスあたりの膵臓腫瘍の体積は、Vevo LAB v.5.5.1 を使用して、楕円体の次の式を使用して分析されました: 体積 (mm3) = π/6 × 長さ × 幅 × 深さ。

TAM 誘導性 Cre 発現の場合、ヒマワリ種子油 (Sigma、88921) で希釈した 2 mg TAM (Sigma、T5648) をマウスに 5 日間連続腹腔内注射するか、TAM (Envigo、TD.130859) を含む固形飼料を与えました。 LRRC15 CAF アブレーションでは、マウスに 25 ng g-1 の DT (Enzo Life Sciences、BML-G135) を週 2 回腹腔内注射しました。 CD8 枯渇研究では、ラット IgG2b アイソタイプ対照抗体またはラット抗 CD8 IgG2b 枯渇抗体 (BioXcell、BE0061) を 10 mg kg-1 の用量で週 3 回腹腔内投与してマウスを治療しました。抗 PDL1 研究では、マウスをアイソタイプコントロール抗体または抗 PDL1 (6E11) 抗体 (社内) で処理しました。最初の用量は 10 mg kg-1 で与えられ、その後は 5 mg kg-1 が週に 2 回腹腔内投与されました。

腫瘍を収集し、重量を量り、小片に切り刻んだ。ナイーブな脇腹皮膚を分離するために、毛を剃り、脂肪組織を除去し、皮膚組織を切り刻んだ。続いて、すべての組織をディスパーゼ (Life Technologies)、コラゲナーゼ P および DNaseI (Roche) のカクテルを使用して 37 °C で 45 分間酵素消化して、単一細胞懸濁液を得ました。 Vi-CELL XR (Beckman Coulter) を使用して細胞を計数しました。サイトカイン染色では、細胞懸濁液を eBioscience Cell Stimulation Cocktail とタンパク質輸送阻害剤 (00-4975-93) で刺激し、10% FBS と 2 mmol l-1 l-グルタミンおよび 2-メルカプトエタノールを含む RPMI に再懸濁し、37°C で 2 時間刺激しました。 C. 特に記載がない限り、細胞は BioLegend または BD Biosciences から購入した以下のモノクローナル抗体で 4 ℃、氷上で 20 ～ 30 分間標識しました。以下の蛍光標識抗体で細胞表面を染色する前に、細胞を Fc ブロック (2.4G2; 1:200、553142) でブロックしました。以下の表面抗体または細胞内抗体を使用しました:CD45 (30-F11、103139)。 EPCAM (G8.8、118218); CD31 (390、561410); PDPN (8.1.1、127410); CD24 (M1/69、612832); LRRC15 (M25、自社製); CD90.2 (53-2.1、565527); CD8 (53-6.7、612759); PD1 (29F.1A12、135225); TIM3 (RMT3-23、119727); LAG3 (C9B7W、125227); CD39 (ドゥハ59、143812); IFNγ (XMG1.2、505846); グランザイム B (GB11、515408); および TNF (MP6-XT22、506324)。生細胞は、表面染色後、カルセインブルー (Invitrogen、C1429、1:1,000) とインキュベートすることによって同定されました。細胞内染色では、BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization kit (554714) を製造元の指示に従って使用して、サンプルを固定、透過処理、および染色しました。 Fortessa、Symphony、または LSRII (BD Biosciences) フローサイトメーターを使用してデータを取得し、FlowJo (Tree Star、v.10.7.1) を使用して分析するか、Fusion または Aria (BD Biosciences) を使用して細胞を選別しました。機器データは Prism GraphPad を使用して処理されました。追加情報は補足表 6 に記載されています。

プレートに結合した抗 CD3 による刺激のために、96 ウェル平底プレートを 10 μg ml-1 の抗 CD3 (BioLegend、100340、クローン 145-2C11) で 4 °C で一晩コーティングし、PBS で 1 回洗浄しました。 DTR- または DTR+ マウスの消化された KPR 皮下腫瘍から関連する原発性 CAF を選別し、3 × 104 細胞を抗 CD3 コートウェル (100 μl) に加えました。細胞の付着を促進するために、細胞を 37 °C で 1 時間インキュベートしました。インキュベーション中に、メーカーのガイドラインに従って、Stem Cell (19853) の EasySep マウス CD8+ T 細胞濃縮キットを使用した免疫磁気ネガティブ選択によって、マウス CD8+ T 細胞をナイーブ脾細胞の単一細胞懸濁液から単離しました。約 6 × 104 個の精製 CD8+ T 細胞を、可溶性 0.50 μg ml-1 抗 CD28 (BioLegend、102115、クローン 37.51) (100 μl) の存在下でウェルに加えました。分析当日、培地を交換し、細胞を 1×細胞刺激カクテル (eBioscience 500×細胞刺激カクテルとタンパク質輸送阻害剤、00-4975) および 55 μM 2-メルカプトエタノールを用いて 37 °C で 4 時間培養しました。細胞を収集し、濾過し、表面マーカーについて染色した。表面染色後、細胞内サイトカインを染色する前に、メーカーのガイドラインに従って細胞内固定および透過処理バッファーセットを使用して細胞を固定および透過処理しました。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。

腫瘍を 4% パラホルムアルデヒドで一晩固定し、最適切断温度媒体 (Sakura Finetek) に包埋し、-80 °C で保存するために凍結しました。切片 (厚さ 8 ～ 12 μm) を凍結切片にし、染色しました。染色のために、スライドをブロックし、正常マウス血清(1:50)、マウスFcブロック(1:100)およびPBSで希釈した0.3% Triton-Xを用いて室温で30分間透過処理した。組織切片を一次抗体とともに室温で 1 時間、または 4 °C で一晩インキュベートしました。洗浄後、二次抗体を室温で 1 時間添加しました。対比染色するために、スライドをリンスし、PBS中300nMのDAPI(ThermoFisher、D1306)とともに室温で5分間インキュベートした。使用した抗体の詳細は補足表 6 に記載されています。スライドを PBS で数回洗浄し、過剰なバッファーを排出し、切片を Vectashield (H-1000) にマウントしました。画像は、Plan apo lambda NA 0.75 ×20 レンズを備えた Nikon A1R 共焦点顕微鏡で取得しました。レーザーは 488 nm、561 nm、640 nm で励起し、完全焦点モジュールに設定されました。 NIS Elements 取得ソフトウェアを、完全な組織切片イメージングの場合は 2、詳細の場合は 7 のデジタルズームで使用し、単一平面画像のステッチングを実行しました。 CD8 T 細胞と LRRC15 CAF の相互作用率の推定値は、3 つの異なる腫瘍にわたる 500 × 500 × 10 µm3 の組織切片の全 T 細胞間で観察された T 細胞と CAF の間でまとめられました。

in situ ハイブリダイゼーション用の組織はホルマリン固定され、パラフィン包埋されました。マウス LRRC15 in situ ハイブリダイゼーションは、ACD プローブ (Advanced Cell Diagnostics、120 分間のハイブリダイゼーション付き 467838) を使用して実行されました。ER2 検索 (Leica) を 95 °C で 15 分間実行し、RNAscope 2.5 LS プロテアーゼ III 消化 (ACD) を Leica Bond で実行しました。検出には RNAscope 2.5 LS Reagent Kit Red (ACD) を使用しました。

マウス scRNA-seq および独自のバーコード付き抗体 (BioLegend) によるセルハッシュは、メーカーの指示に従って Chromium Single Cell Gene Expression 3' v3 Library および Gel Bead キットを使用して処理されました (10x Genomics、PN-1000075)。 Vi-CELL XR セルカウンター (Beckman Coulter) を使用して細胞を計数し、生存率をチェックした後、マイクロ流体チップに注入して、10x クロム装置内でゲルビーズインエマルションを形成しました。逆転写は、ゲルビーズインエマルション上で実行され、生成物が精製および増幅されました。抗体由来タグの DNA は、SPRIselect ビーズ (Beckman Coulter、B23318) を使用したサイズ選択に基づいて cDNA から分離されました。発現ライブラリーおよび抗体由来タグライブラリーを生成し、Bioanalyzer High Sensitivity DNA キット (Agilent Technologies、5067-4626) を使用してプロファイリングし、Kapa Library Quantification キット (Roche、07960255001) で定量しました。すべてのライブラリーは HiSeq4000 および NovaSeq (Illumina) を使用して配列決定されました。

各細胞タイプからの各ライブラリーの scRNA-seq データは、マウス参照ゲノム GRCm38 および GENCODE 遺伝子モデルに基づくカスタム参照を使用して CellRanger count (CellRanger 3.1、10x Genomics) で処理されました。個々の複製を標識するためのバーコード抗体の数は、デフォルトのパラメーターを使用して DemuxEM を使用して処理され、個々のサンプル標識が割り当てられました 30。ダブレットまたは HTO 陰性細胞として識別された細胞は分析から除外されました。遺伝子発現数については、個々のサンプルを 1 つの発現マトリックスに統合し、パッケージ Seurat を使用して分析しました。発現遺伝子数が 300 未満、またはミトコンドリア数が 5% を超える細胞は除去されました。転写物数は対数正規化され (Seurat、NormalizeData)、分散安定化変換 (FindVariableFeature) とそれに続くデータスケーリング (ScaleData) を使用して、最も変動しやすい上位 2,000 個の遺伝子が選択されました。次に、この遺伝子空間に対して PCA を実行しました (RunPCA)。クラスタリングは、セル間の共有最近傍 (FindNeighbors、30 PC) およびグラフベースのクラスタリング (30 PC、Lrrc15 枯渇の解像度 0.1、Tgfbr2 KO 実験の解像度 0.5) に基づいて実行されました。 Seurat の FindMarkers 関数を使用して、個々のクラスターのマーカーを計算しました (Wilcoxon の順位合計検定、複数検定の Benjamini-Hochberg 調整)。個々のクラスターの遺伝子発現レベルを視覚化するために、各クラスターの平均遺伝子発現を計算し、遺伝子ごとに Z スコア値を計算しました。

DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl 実験では、最初のデータ処理ステップで得られた Seurat オブジェクト内の細胞が、既知の細胞型マーカーの発現に基づいてさらにフィルター処理されました。 Lum および Dcn を発現するクラスター 0、2、3、4、5、および 8 の線維芽細胞のみを、その後の分析のために保持しましたが、Pecam1 (内皮細胞)、Ptprc (免疫細胞)、または Rgs5 (周皮細胞) は保持しませんでした。次に、上記のように次元削減とクラスタリングを実行し、残っている少量の汚染物質である非線維芽細胞細胞を除去しました。最終的な次元削減とクラスタリングは、30 台の PC と 0.3 のクラスタリング解像度を使用して実行されました。

Lrrc15DTRGFP 枯渇実験では、最初のデータ処理ステップで得られた Seurat オブジェクト内の線維芽細胞 (クラスター 0、1、2、および 5) を、Pecam1 (内皮細胞)、Ptprc (免疫細胞)、Rgs5 (周皮細胞）、Krt18（上皮細胞）またはMyl1（平滑筋細胞）。次に、上記のように次元削減とクラスタリングを実行し、残っている少量の汚染物質である非線維芽細胞細胞を除去しました。最終的な次元削減とクラスタリングは、30 台の PC と 0.2 のクラスタリング解像度を使用して実行されました。

Seurat の addModuleScore 関数と目的の遺伝子セットを入力として使用して、遺伝子発現プログラムについて細胞をスコアリングしました。 PDAC マウス GEMM プログラムは次のように派生しました。我々は、以前の研究1からのTGFβ CAF（クラスター2）において少なくとも0.6平均log倍変化上方制御を有する遺伝子を、これらの状態のマーカー遺伝子として使用した。正常組織線維芽細胞 (クラスター 3 および 4) 遺伝子セットを特定するために、Seurat の FindMarkers 機能を使用してクラスター 3 および 4 の上位 20 マーカーを特定し、これらをデータセット内の他のすべての細胞と比較しました。

条件間の特定のクラスターからの細胞の存在量の違いを評価するために、細胞型の割合の有意な違いを見つけるために設計された R パッケージ speckle (https://github.com/Oshlack/speckle) を使用しました。簡単に言うと、スペックルは、生物学的複製ごとに特定のクラスターに割り当てられた細胞の割合を計算し、その割合に対して分散安定化変換を実行し、細胞タイプの割合が異なるグループ間で有意であるかどうかを判断します。すべての実験で 2 つのグループのみを比較したことを考慮すると、スペックルによって t 検定を使用して P 値を計算し、ベンジャミニ・ホッホベルグ補正を使用して複数の検定用に調整しました。

私たちは、PROGENy17 を使用して、以前に説明したように 10 、著者が提供する単一細胞チュートリアル (https://saezlab.github.io/progeny/articles/ProgenySingleCell.html) に従って、単一細胞遺伝子発現データから経路活性を推測しました。子孫スコアをクラスターまたは実験時点/条件と照合し、集団ごとにデータを要約しました。

マッピングされた読み取り値 100 万件あたりの配列の 1 キロベースあたりの正規化されたフラグメントは、参考文献の補足表 6 から取得されました。 12. データを対数変換し、Lrrc15 および Gapdh の発現レベルを組織ごとに視覚化しました。

バッチ補正された正規化 TCGA Pan-Cancer mRNA データは、UCSC Xenabrowser (https://xenabrowser.net/) から取得されました (N = 11,060)。 NA 発現値を含むサンプルは除去されました。さらに、原発性固形腫瘍からのサンプルのみを含むようにデータをフィルター処理しました (サンプルコード 01; N = 9,702)。生存データは参考文献の表S1から取得しました。 31 に関連付けられており、固有の TCGA 参加者バーコードを使用して Pan-Cancer データセットにリンクされています。患者数が 80 人未満の適応症は分析から除外されました (最終データセット: N = 9,195 人の患者)。 TGFB CAF レベルは、サンプル全体の各遺伝子の Z スコア変換後のサンプル内で以前に公開されたマーカーシグネチャ 1 の平均発現を計算することによって推定されました。 TCGA データ全体にわたる生存との関連性は、多変量コックス回帰と共変量としての TCGA 適応症、および各適応症内の単変量コックス回帰分析を使用して決定されました。ハザード比は、TGFβ CAF スコアが 1 単位増加した場合の死亡リスクの変化として定義されました。

Immunoprofiler Initiative (IPI) 用の腫瘍サンプルは、さまざまながん手術室や外来診療所から輸送されました。すべての患者は、治験審査委員会によって承認された UCSF プロトコール (UCSF IRB 20-31740) に基づく組織採取について、カリフォルニア大学サンフランシスコ校 (UCSF) IPI 臨床コーディネーターグループに同意しました。外科的切除後にサンプルを採取し、腫瘍細胞の存在を確認するために病理学助手が採取した生検を行った。患者は以前の治療に関係なく選択されました。新たに切除したサンプルを、50 ml コニカルチューブ内の氷冷 PBS または Leibovitz's L-15 培地に置き、サンプルの標識と処理のために直ちに研究室に輸送しました。サンプルは、組織全体を消化して単一細胞懸濁液にするか、組織の一部をスライスして画像解析用に保存するために使用されました。

細胞選別、ライブラリー調製、配列決定、およびバイオインフォマティクスデータ処理は、前述のように実行されました 32。

正規化された遺伝子 × 細胞発現値の対数変換行列から、四分位範囲に基づいて最も可変性の高い 2,500 個の遺伝子を特定し、これらの遺伝子の空間で PCA を実行しました。次に、サンプルと遺伝子の階層的クラスタリング (完全な連鎖とユークリッド距離) に、PC1 ～ PC6 の最も強くポジティブおよびネガティブな負荷を与える 10 個の遺伝子を使用しました。クラスター樹状図は、木の高さに基づいて k = 6 クラスターに分割されました。 EPCAM、KRT8、およびKRT18の高発現を示すサンプルのクラスターは上皮駆動型、TYROBPおよびCSF3Rは骨髄駆動型と解釈し、これらのサンプルをその後の分析から除外しました。次に、残りのサンプルに対して PCA を実行しました。次に、得られた PC 空間の負荷を使用して、上皮および骨髄駆動サンプルを PC1 および PC2 に投影しました。同様に、参考文献に提供されているように、PDAC患者からのバルクRNA-seqサンプルを顕微解剖しました。 33 は Gene Expression Omnibus データベース (識別子 GSE93326) から取得され、PC1 および PC2 に投影されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

生および処理された scRNA-seq データセットは、アクセッション番号 E-MTAB-12028 および E-MTAB-12036 で ArrayExpress リポジトリから入手できます。ヒト間質細胞のバルク RNA-seq データは、European Genome-Phenome Archive データベースでアクセッション EGAD00001009176 として入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

この原稿のために新しいアルゴリズムは開発されていません。分析用に生成されたすべてのコードは、リクエストに応じて作成者から入手できます。

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ディスカッションと実験の支援についてはターリー研究所のメンバー、そしてビバリウムのメンテナンスと中核施設の支援についてはジェネンテックの施設スタッフに感謝します。この研究で説明されている特定のヒトサンプルの取得と分析は、UCSF によって実施され、UCSF IPI の一環としてアッヴィ、アムジェン、ブリストル・マイヤーズスクイブ、ジェネンテック、ファイザーからの寄付によって部分的に資金提供されました。マウス、人間、細胞のイラストは BioRender.com で作成されました。この研究は Genentech によって支援されました。

ジェネンテック、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

アクシャイ・T・クリシュナムルティ、ジャスティン・A・シャイアー、ミン・タイ、ヴィニーラ・ガンダム、マシュー・B・ビュークラー、イェチン・アンジェラ・ヤン、ラチャナ・N・プラダン、アンバー・W・ワン、パトリシア・L・サンチェス、ヤン・クー、ベアトリス・ブアート、セシル・チャルーニ、デブラダンラップ、ジェームズ・ザイアイ、ジャスティン・エルストロット、ニーリー・ザカリアス、ウェイグアン・マオ、レベッカ・K・ラウンツリー、ジャック・サドウスキー、ゲイル・D・ルイス、トーマス・H・ピロー、バージン・Y・ナベット、ロマン・バンシュロー、ルシンダ・タム、ロジャー・カオシアン、ナターシャ・バカロ、メローネルース=ギルマ、ゾラ・モドルサン、サンジーブ・マリアササン、セーレン・ミュラー、シャノン・J・ターリー

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コンセプト化: ATK、S. ミュラー。および SJT 方法論: ATK、S. ミュラー。および SJT ソフトウェア、正式な分析とデータキュレーション: AWW および S. Müller。調査: ATK、JAS、MT、VG、MBB、YAY、RNP、PLS、YQ、BB、CC、DD、JZ、JE、NZ、WM、RKR、JS、GDL、THP、BYN、RB、LT、RC、 NB、MR-G.、ZM、S. マリアササン。執筆: ATK、S. ミュラー。 SJT 視覚化: ATK、MT、CC、RNP、JZ、S. Müller。監修：S.ミュラー。とSJT

Sören Müller または Shannon J. Turley との通信。

著者は全員、Roche グループのメンバーである Genentech Inc. の従業員です。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Mara Sherman と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

ａ． Dptwt/wtRosa26LSLYFP+/- および Dptki/kiRosa26LSLYFP+/- マウスへの移植後 21 日目の皮下 KPR 腫瘍から、代表的なフローサイトメトリープロット (左) と PDPN+CD31- 線維芽細胞における Dpt-YFP+ 細胞の頻度の定量化 (右) を示しています (n =マウス6匹）。ビ。ｂを示す図１ａの実験レジメン後のＤｐｔｗｔ／ｗｔＴｇｆｂｒ２ｆｌ／ｆｌマウスおよびＤｐｔｋｉ／ｋｉＴｇｆｂｒ２ｆｌ／ｆｌマウスへの移植後２１日目の皮下ＫＰＲ腫瘍から。代表的なフローサイトメトリーのヒストグラム (左) および PDPN+CD31- 線維芽細胞における TGFβR2+ 細胞の頻度の定量化 (右) (n = 10 マウス)。 c. CD24-CD45-間質細胞およびCD45+免疫細胞の代表的な選別前ゲーティング戦略（左）および選別後の純度分析（右）ｄ．クラスターメンバーシップ (左)、マーカー遺伝子発現 (中央)、および UMAP からのクラスター内の個々の細胞ハッシュサンプルの頻度によって色付けされた 10,136 個の間質および免疫細胞の UMAP プロット (グループあたり n = 5 マウス)。 e. 図1eの各クラスター内の細胞のTgfb CAF PDAC GEMM遺伝子シグネチャのスコアを示すバイオリンプロット。 f、g。図1fのようなUMAPは、示されたマーカーの発現によって色付けされています。 h. 図1eの各条件からの各クラスター内の細胞の割合（条件あたりn = 5動物）。私。 eと同じ遺伝子セットのスコア。ここでは図1eの増殖クラスター（C4）内の細胞のスコアであり、条件によって分割されています。 a、b のデータは、2 つまたは 3 つの独立した実験からプールされています。 a、b のデータは平均 +/- sd であり、h のデータは平均 + sem です。 a、b、h の統計は、両側の対応のないスチューデント t 検定を使用して計算されました。

ソースデータ

ａ．ヒト腫瘍から選別された CAF 集団の分析戦略: 左: すべてのサンプルに対して PCA を実行し、各 PC から 20 個の最も強い陽性および陰性負荷遺伝子を抽出しました。中: 階層的クラスタリングが実行され、汚染のないサンプルが分離されました。右: これらの純粋なサンプルに対して PCA を実行しました。いくつかの汚染を含むサンプルを、純粋なサンプルから得られたこの PCA 空間に投影して、図 1l を導き出しました。 b. 図１ｌのＰＣ１に沿った正常隣接組織（Ｎ）および腫瘍組織（Ｔ）の分布。 c. 図 1b で得られた 123 個の顕微解剖 PDAC RNA-seq サンプルの PCA 空間への投影。 d. 図 1p と同じフォレストプロット。ここでは TCGA のすべてのがん適応を対象としています。 b、c のデータでは、ひげは最小値と最大値を表し、ボックスは IQR を表し、中心線は中央値を表します。 d のデータでは、中心点はハザード比を示し、線は 95% 信頼区間を表します。統計量は、d の Cox 比例ハザード回帰モデルを使用して計算されました。

ソースデータ

ａ． PDPN+ 線維芽細胞、CD31+ 血液内皮細胞 (BEC)、PDPN-CD31- 間質細胞、CD45+ 免疫細胞、および CD24+ 腫瘍細胞における移植後 17 日目の皮下 KPR 腫瘍における LRRC15+ 細胞の頻度の定量化 (n = 10 マウス)。 b. 移植後 17 日目の選択された健康なマウス組織および皮下 KPR 腫瘍組織の代表的な LRRC15 in situ ハイブリダイゼーション画像。 c. Lrrc15 および Gapdh (コントロール) の発現を示す 17 個の正常マウス組織のバルク RNAseq データ。組織ごとのサンプル数はソースデータに含まれています。 DF。ｄ．からのＦａｐ、Ａｃｔａ２、およびＬｒｒｃ１５遺伝子発現。 Dptwt/wtTgfbr2fl/fl マウスへの移植後 21 日目の KPR 腫瘍由来の線維芽細胞、免疫細胞、内皮細胞、および周皮細胞の scRNAseq 分析。 e. マウス組織にわたる Pdgfrα+ 定常状態線維芽細胞の scRNAseq。 f. Ccl19 発現を伴うマウス未処理皮膚流入リンパ節由来の線維芽細胞および周皮細胞の scRNAseq。 a のデータは 3 つの独立した実験からプールされています。 b のデータは 1 つの独立した実験を表しています。 a のデータは平均 +/- sd です。c のデータでは、ひげは最小値と最大値を表し、ボックスは IQR を表し、中心線は中央値を表します。 a の統計は、通常の一元配置分散分析検定を使用して計算されました。

ソースデータ

a、b。 DTR- および DTR+ マウスの PBS または DT 治療後 8 日目の皮下 KPR 腫瘍から。ａ． PDPN+CD31-線維芽細胞におけるLRRC15+細胞の頻度を示す代表的なフローサイトメトリープロット、およびb．腫瘍重量によって正規化されたＰＤＰＮ＋ＬＲＲＣ１５＋細胞の総数の定量化（ｎ＝６マウス）ｃ． DT 後 7 日目 (n = 8 または 9 マウス)、14 日目 (n = 10 マウス)、および 21 日目 (n = 10 マウス) における PDPN+LRRC15+ 細胞 (左) および PDPN+CD31- 線維芽細胞 (右) の頻度の定量化皮下 KPR 腫瘍を有する DTR- および DTR+ マウスの治療。 d. DT で治療した DTR- および DTR+ マウスの体重変化曲線 (n = 9 または 11 マウス/グループ)。全動物の平均体重変化（左）。遺伝子型ごとの個々の体重変化曲線 (右)。 X軸はDT治療後の日数を表します。 b、c のデータは、2 つまたは 3 つの独立した実験からプールされています。 d のデータは 3 つの独立した実験の代表です。 b、c、d のデータは平均 +/- sd です。統計量は、b では通常の一元配置 ANOVA 検定を、c では通常の二元配置 ANOVA 検定を使用して計算されました。

ソースデータ

ａ．皮下 KPR 腫瘍組織 (上) またはナイーブ皮膚組織 (下) 由来の間質細胞の代表的なソート前のゲーティング戦略 (左) とソート後の純度分析 (右)。 b. クラスターのメンバーシップによって色付けされた 54,240 個の間質細胞の UMAP プロット (左)。左の UMAP 。ここでは、示されたマーカー遺伝子発現 (中央) と UMAP からのクラスター内の個々の細胞のハッシュサンプルの頻度 (右) によって色付けされています。各クラスター内の上位 5 つのマーカー遺伝子の相対平均発現 (下)。 c. 3b の UMAP (D0,7,14,21; 左、D7,14,21; 右) は、Cxcl12 の発現によって色分けされています。 d. 腫瘍を有するサンプルにおける 4 つの時点すべてにおける各条件 (n = 5 動物/条件) における図 3b の C1、C2、および C5 の細胞の割合。 e. 図3bの各クラスターの細胞のナイーブ皮膚C3/C4遺伝子サインのスコアを示すバイオリンプロット。 f. 図3bの各クラスターごとにプールされた細胞のPROGENY経路濃縮スコア（色）。 d のデータは平均値 + sem です。d の統計量は、両側対応のないスチューデント t 検定を使用して計算されました。

ソースデータ

ａ． CD8 枯渇抗体またはアイソタイプ対照と組み合わせた、DT 処理皮下 KPR 腫瘍担持 DTR- および DTR+ マウスからの個々の腫瘍増殖曲線 (n = 10 マウス/グループ)。赤い破線は、対照群 (DTR- + アイソタイプ) からの平均参照適合度を表します。 b. LRRC15 および CD8 で染色された皮下 KPR 腫瘍の免疫蛍光分析 (左)、および LRRC15+ CAF から 2um 未満の近傍にある CD8+ T 細胞の頻度の定量化。 CD。 4fの結果に関するCAF-CD8+ T細胞共培養実験の実験スキーム(c)および選別戦略(d)。 e、f。 aPDL1 抗体またはアイソタイプ対照と組み合わせた、DT 処理皮下 KPR 腫瘍担持 DTR- および DTR+ マウスから e．個々の腫瘍増殖曲線を示す 2 つの独立した研究 (研究 1: n = 9 または 10 マウス/グループ、研究 2: n = 9 または 11 マウス/グループ)。赤い破線は、対照群 (DTR- + アイソタイプ) からの平均参照適合度を表します。 f. 腫瘍体積が 1000m3 に達するか、または腫瘍潰瘍化が 5mm を超えるまでの時間の生存分析 (n = 9 または 10 マウス/グループ)。 b のデータは平均 +/- 標準誤差です。a、f のデータは 2 つの独立した実験を表します。 f の統計量は、ログランクマンテル-コックス検定を使用して計算されました。

ソースデータ

a～e。 aPDL1 抗体またはアイソタイプ対照と組み合わせた、DT 処理された同所性膵臓 KPR 腫瘍を有する DTR- および DTR+ マウスから。すべての治療グループおよび時点における膵臓 KPR 腫瘍の代表的な超音波画像。青い斜線は腫瘍の周囲をマークします。 b. 個々の腫瘍増殖曲線 (n = 7 マウス/グループ)。赤い破線は、対照群 (DTR- + アイソタイプ) からの平均参照適合度を表します。 c. PDPN+CD31-線維芽細胞におけるLRRC15+細胞の頻度を示す代表的なフローサイトメトリープロットd、e。腫瘍重量によって正規化された PDPN+LRRC15+ 細胞 (d) および PDPN+CD31+ 細胞 (e) の総数の定量化 (n = 5 マウス)。 d、e のデータは平均 +/- sd です。ae のデータは 1 つの独立した実験を表します。 d、e の統計は、通常の一元配置分散分析検定を使用して計算されました。

ソースデータ

DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl scRNA-seq 実験のすべての細胞のマーカー。

DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl scRNA-seq 実験用の線維芽細胞のマーカー。

IPI コホートの患者情報。

Lrrc15DTR 動態 scRNA-seq 実験用のすべての細胞のマーカー。

Lrrc15DTR 動態 scRNA-seq 実験用の線維芽細胞のマーカー。

この原稿で使用される抗体に関する情報。

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転載と許可

クリシュナムルティ、AT、シャイアー、JA、タイ、M 他。 LRRC15+ 筋線維芽細胞は、腫瘍免疫を抑制する間質の設定値を決定します。 Nature 611、148–154 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41586-022-05272-1

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受信日: 2021 年 7 月 14 日

受理日: 2022 年 8 月 24 日

公開日: 2022 年 9 月 28 日

発行日: 2022 年 11 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05272-1

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